Tarea 2.a Exactitud (Rocío)

Explicar qué habría que hacer en el laboratorio para validar una metodología analítica o para controlar su calidad en lo referente a exactitud y precisión:

a) Exactitud: materiales de referencia, métodos oficiales de análisis, etc.. que se pueden

utilizar en el caso concreto del trabajo asignado a cada grupo.

La exactitud se define, según la guía ISO 35354-1 [ISO 1993], como "la proximidad en la concordancia entre un resultado y el valor de referencia aceptado". Se dice entonces que un resultado es exacto si no presenta errores sistemáticos o al menos si estos errores son aceptables. Se relaciona con la existencia de un error sistemático que hace que los resultados se desvíen de manera constante con respecto a los valores esperados.

Por tanto, se refiere a la desviación de un resultado con respecto al valor verdadero.

La exactitud de un método analítico se puede evaluar en el laboratorio de diversas maneras:

1. Mediante el uso de materiales de referencia certificados

2. Usando método de referencia establecidos por diversos organismos oficiales

3. Preparando una muestra de referencia en el laboratorio

4. Realizando ejercicios de intercomparación entre laboratorios

MÉTODOS DE REFERENCIA CERTIFICADOS (MRC)

Antes de definir que es un MRC debemos saber que es un material de referencia, que según la guía ISO 30 [ISO, 1992], es un “material o sustancia que tiene una o varias de sus propiedades suficientemente bien establecidas para calibrar un aparato

o instrumento, validar un método analítico, o asignar valores a un material o

sistema”.

Los métodos de referencia certificados se definen según la guía ISO [ISO, 1992], como un “materiales de referencia que tienen certificados uno o varios de sus valores de una o más de sus propiedades por procedimientos técnicamente válidos llevados a cabo por un organismo competente".

Para que un material de referencia pueda ser considerado MRC debe cumplir los siguientes requisitos:

Trazabilidad. El MRC debe ser trazable a patrones de referencia nacionales o

internacionales. Esto debe quedar perfectamente reflejado en el certificado que

aporte el organismo productor.

Homogeneidad. Éste es un requisito indispensable, y significa que un MRC ha

de presentar el mismo valor de la propiedad certificada dentro de una misma

unidad y entre todas las unidades del MRC.

Estabilidad. El material debe ser estable durante las condiciones de envío, y

el usuario debe conocer durante cuánto tiempo permanece estable el MRC

desde su recepción y desde que se abre el recipiente [ISO, 2000a]. La

estabilidad tiene que referirse tanto a las propiedades certificadas como a la

matriz. Algunos MRC pueden verse afectados por numerosos factores como la

luz, la temperatura o la exposición a la atmósfera, por lo que el fabricante

deberá indicar las condiciones de transporte, manejo y almacenamiento

recomendadas para el material [ISO, 2000b].

Similitud con las muestras reales. El MRC ha de ser lo más parecido posible,

tanto en la composición de la matriz como en el valor de la propiedad a

determinar, a las muestras reales que serán posteriormente analizadas con

nuestro método analítico.

Incertidumbre. Los valores certificados de la propiedad deseada en el MRC

deben ir acompañados por sus valores de incertidumbre. El nivel de

incertidumbre asociado también informa de la calidad de un MRC en concreto.

Una vez sabemos lo que es un material de referencia certificado, ahora solo nos queda adquirir el más adecuado, teniendo en cuenta que nuestro análisis consiste en la determinación de cromo hexavalente en agua.

Lo primero que debemos hacer es consultar los diversos catálogos que nos ofrecen laboratorios especializados y escoger el que más nos convenga, nosotros en nuestro caso escogimos el laboratorio Mol labs.

Según este catálogo podríamos utilizar los siguientes MRCs:

R1954: Agua deionizada 5 uS por L

R1953: Agua deionizada 5 uS por 4 L

R1952: Agua deionizada 5 uS por 20 L (No incluye transporte)

R2004: Agua destilada, por L

R2003: Agua destilada por 4 L

R2002: Agua destilada por 20 L (No incluye transporte)

Teniendo en cuenta la naturaleza y propiedades del agua que tengamos en la muestra a analizar, escogeremos aquel MRC que nos ofrezca la matriz más similar, y cumpla los requisitos anteriormente citados.

MÉTODO DE REFERENCIA ESTABLECIDOS POR DIVERSOS ORGANISMOS OFICIALES

Si nos llega una muestra de orina procedente de los trabajadores de una mina, y nos mandan determinar la presencia y concentración de Cromo debemos utilizar el método oficial publicado por el Ministerio de trabajo y asuntos sociales de España, en su apartado dedicado al Instituto de seguridad e higiene en el trabajo.

El método que vamos a utilizar consiste en: "Determinación de cromo en orina - Método de cámara de grafito/ Espectrofotometría de absorción atómica", este es un método aceptado por el Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo (INSHT).

Para llevar a cabo este análisis debemos disponer de los siguientes reactivos y aparataje en nuestro laboratorio:

REACTIVOS

Durante el análisis, se utilizarán reactivos de calidad "para análisis" o superior.

1. Agua destilada o desionizada

El agua será de grado 2 de pureza como mínimo de acuerdo con ISO 3696 (9.8.).

2. Ácido nítrico HNO3, concentrado.

3. Heptaoxo dicromato (VI) de potasio K2Cr2O7 (Dicromato de potasio).

4. Disolución patrón de cromo de 1000 μg/ml

Puede utilizarse una disolución patrón comercial de una concentración de 1000 μg/ml. Si se utiliza dicha disolución habrá que tener en cuenta la fecha de caducidad indicada por el fabricante.

APARATOS Y MATERIAL

1. Frascos de polietileno de 25 ml de capacidad, exentos de cromo.

2. Cubiletes desechables de poliestireno, de fondo cónico y de 2 ml de capacidad.

3. Tubos de grafito pirolizados, de 28 mm de longitud y 6 mm de diámetro interno.

4. Pipetas automáticas y dosificadores que cumplan los requisitos recogidos en ISO 8655.

5. Material de vidrio de borosilicato 3.3 de acuerdo con ISO 3585.

6. Cámara de grafito.

7. Espectrofotómetro de Absorción Atómica equipado con lámpara de cromo y corrector de absorción inespecífica.

Una vez disponemos de todo esto, comenzaremos con el proceso analítico.

PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS

1. Limpieza de material

1.1. Todo el material de vidrio utilizado en el análisis, después de su lavado con un detergente, debe mantenerse sumergido varios minutos en ácido nítrico al 50% (V/V) y ser después cuidadosamente enjuagado con agua.

1.2. Los tubos de grafito nuevos y usados, tras un período fuera de uso, deben acondicionarse siguiendo las recomendaciones del fabricante.

1.3. Las ventanas de cuarzo de la cámara de grafito deben limpiarse periódicamente para eliminar las salpicaduras que sobre ellas se depositan.

1.4. Los conos de plástico para las micropipetas y los cubiletes de poliestireno deben mantenerse en sus bolsas de origen hasta el momento de su uso, para evitar cualquier contaminación.

2. Preparación de la muestra

2.1. Se depositan 10 μl de ácido nítrico concentrado en un cubilete de fondo cónico.

2.2. Se añaden 400 μl de agua destilada.

2.3. Se pipetean 200 μI de orina con pipeta automática, procurando no arrastrar el posible sedimento depositado en el fondo. Con el mismo cono de plástico utilizado se remueve el contenido del cubilete hasta conseguir una completa homogeneización. La muestra así preparada está lista para su introducción directa en el homo de grafito.

3. Preparación de patrones y curva de calibración

3.1. Disoluciones de trabajo.

A partir de la disolución de cromo de 1000 μg/ml y con las diluciones pertinentes con agua destilada, se preparan las disoluciones de trabajo de 0,005; 0,01 y 0,02 μg de cromo por ml de agua.

3.2. Patrones de adición.

Se preparan añadiendo a sendos cubiletes, que contienen cada uno 10 μl de ácido nítrico concentrado, 200 μl de agua destilada, 200 μl de orina de bajo contenido en cromo y 200 μl de las disoluciones de trabajo preparadas anteriormente. Las concentraciones de los patrones de adición así obtenidos son de 0,005; 0,01 y 0,02 μg de Cr por ml de orina.

3.3. Blanco de orina.

Se obtiene añadiendo sucesivamente a un cubilete de fondo cónico, 10 μl de ácido nítrico concentrado, 400 μl de agua destilada y 200 μl de la orina utilizada para preparar los patrones de adición.

3.4. Blanco de reactivos.

Se prepara depositando en un cubilete, 10 μl de ácido nítrico concentrado y 600 μl de agua. Es necesario para detectar la presencia de cromo en los reactivos y material empleados, y efectuar las oportunas correcciones.

3.5. Curva de calibración.

De las lecturas, en absorbancia o altura de pico, obtenidas para los patrones preparados y analizados según 6.4., que corresponden a concentraciones de 0,005; 0,01 y 0,02 μg Cr/ml orina, se resta la lectura obtenida para el blanco de orina definido según 6.3.3.

DETERMINACIÓN

No debe mirarse directamente al tubo de grafito durante el proceso de atomización para evitar posibles lesiones oculares debidas a la radiación.

1. Se introducen 20 μl de blancos, patrones y muestras, en el tubo de grafito con una pipeta automática o bien con un introductor automático de muestras si se dispone de él.

2. El análisis se efectuará con un programa de temperaturas y tiempos lo más similar posible a los datos del cuadro .

3. Se mide la altura del pico registrado, durante la etapa de atomización, a 357,9 nm. Es necesaria la utilización de un sistema adecuado para la corrección de la absorción no específica.

4. Las determinaciones de muestras y patrones deben efectuarse al menos por duplicado. El elevado número de variables que intervienen en la determinación y la dificultad en controlarlas todas de forma precisa y continua, hace aconsejable la introducción de muestras de orina de concentración conocida entre las muestras reales.

5. Es importante en orden a establecer unos resultados reproducibles, asegurarse del buen estado de conservación de los contactores de grafito (cilindros), limpiándolos periódicamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante y cambiándolos cuando su grado de deterioro así lo aconseje.

CÁLCULOS

1. Determinación de la concentración de cromo en la curva de calibración.

La concentración de cromo en μg de Cr/ml de orina se obtiene por interpolación del valor obtenido para la muestra, previa sustracción del valor del blanco de reactivos, en la curva de calibración.

2. Determinación de la concentración de cromo en la muestra.

Los resultados, expresados en microgramos de cromo por litro de orina (μg Cr/I) se obtienen mediante la siguiente expresión.

C = c x 1000

donde:

C es la concentración de cromo en la muestra en μg Cr/I de orina.

c es la concentración de cromo en μg Cr/ml de orina, leída en la curva de calibración.

PRUEBA INTRALABORATORIO

PREPARACIÓN DE MUESTRAS DE REFERENCIA EN EL LABORATORIO

Una muestras de referencia se define como la muestra de un lote de material de partida, material de

acondicionamiento o de producto terminado que se conserva con el propósito de servir

como muestra para análisis en caso de que sea necesario, durante el periodo de validez

del lote en cuestión. Siempre que la estabilidad lo permita, se conservarán asimismo

muestras de productos obtenidos en fases intermedias críticas de la fabricación (p.e.

aquellos que requieran controles analíticos y liberación) o de productos intermedios que

se envíen fuera del control del fabricante.

Para preparar las muestras de referencia debemos preparar varias disoluciones de concentraciones de analito y disolvente conocidas, que en nuestro caso son cobre hexavalente y agua respectivamente.

REALIZANDO EJERCICIOS DE INTERCOMPARACIÓN ENTRE LABORATORIOS

Para la realización de estudios entre laboratorios debemos tener en cuenta diversos elementos:

RESPONSABILIDADES

• En los centros donde exista una dirección o un departamento de aseguramiento de la calidad, serán éstos los responsables de coordinar y garantizar metodológicamente los estudios interlaboratorios, a solicitud del jefe del laboratorio.
• El jefe del laboratorio será el responsable de planificar estos estudios de forma sistemática y enviará la información al departamento de aseguramiento de la calidad.
• Cuando el laboratorio no posea muestras certificadas para utilizarse como material de ensayo en estos estudios, será responsabilidad del jefe de departamento o laboratorio su elaboración.
• La elaboración de muestras de referencia por parte de los laboratorios constituye un ejercicio de rigor, que implica la validación de estas muestras desde el punto de vista de exactitud y precisión, y, en algunos casos, de acuerdo con el material base empleado, es necesario realizar estudios de conservación y almacenamiento de éstas, lo cual es responsabilidad del laboratorio (Ministerio de Salud Pública. Programa de control externo para laboratorios clínicos. Hospital "Hermanos Ameijeiras", La Habana, 1987).

DEBERES DE LOS PARTICIPANTES

• Analizar el material en el tiempo establecido.
• Cuando el estudio se realiza para evaluar un método analítico, debe seguirse estrictamente lo indicado en el método, sin omitir pasos o cambiar equipos y reactivos.
• Realizar el número indicado de determinaciones, ni más ni menos.
• Expresar los resultados en la forma que se solicita.
• Suministrar todos los datos que sean solicitados, como: gráficos, curvas de calibración y otros.
• Informar los valores según las indicaciones del instructivo que le ha sido enviado junto con las muestras que se deben analizar.
• Informar cualquier incidencia ocurrida durante la ejecución del ensayo.

DERECHOS DE LOS PARTICIPANTES

• En el caso de evaluar un método analítico, recibir con anticipación la metodología a fin de familiarizarse con ella.
• Podrán solicitar más material si así lo desean para una mayor identificación con el estudio.
• Tienen derecho a que los resultados de su laboratorio sean de conocimiento sólo para su laboratorio y el centro coordinador.

CONDICIONES DE SEGURIDAD
CONFIDENCIALIDAD DE LOS RESULTADOS

El coordinador del estudio deberá establecer un sistema de codificación con el objetivo de garantizar la confidencialidad de los resultados, los cuales serán sólo de conocimiento del centro coordinador y no podrán utilizarse con fines diferentes a los de la evaluación para los que fue previsto el estudio.

CONDICIONES DE SEGURIDAD
EN LA PREPARACION Y MANIPULACION DE LAS MUESTRAS

Cuando el laboratorio necesita preparar las muestras de referencia, deberá cumplimentar los siguientes aspectos:

• Garantizar la homogeneización de las muestras.
• Emplear métodos de conservación de acuerdo con el tipo de muestra y los fines para los que se ha previsto (liofilización, congelación o esterilización entre otros).
• Evaluar las muestras preparadas, antes de su empleo, desde el punto de vista de su exactitud, precisión y durabilidad.
• En la preparación de las muestras no se emplearán utensilios, cristalería y equipos que puedan contaminar el producto (muestra de referencia); esto es válido para los envases, los cuales deben garantizar un cierre hermético.
• Enviar las muestras por procedimientos ágiles, que permitan que éstas lleguen a su destino en el menor tiempo posible y con seguridad, por lo que el embalaje de ellas será adecuado para su protección.
• Para que los resultados sean confiables, se deberán cumplimentar todas las indicaciones que aparecen en el instructivo que envía el centro coordinador.

CONDICIONES DE SEGURIDAD EN LOS LABORATORIOS

Cada laboratorio deberá seguir las indicaciones establecidas para la manipulación de sustancias peligrosas o equipamientos que representan riesgo al personal.

Antes de ejecutar el estudio interlaboratorio se realizarán algunas acciones entre las que se encuentran las siguientes:

SELECCION DE LABORATORIOS

• Según sean los objetivos para los que se haya previsto el estudio, se hará una selección de mayor o menor rigor, desde el punto de vista de competencia técnica y equipamiento que incluye la existencia de medidas de control interno de la calidad.
• Es importante valorar la disposición de los técnicos y dirigentes del laboratorio para participar en el estudio interlaboratorio.
• Para lograr una validez estadística se debe tener un gran número de laboratorios participantes; éste nunca debe ser menor que 8 y cuando se emplea un solo nivel de magnitud no debe ser inferior a 15. Cuando se posea cierta experiencia por estudios previos se pueden aceptar hasta 5 laboratorios como mínimo.2,5
• Cuando no existan referencias acerca del método analítico que debe emplearse o éstas sean escasas, es necesario realizar estudios pilotos con pocos laboratorios para obtener nociones sobre los índices de precisión y exactitud.

DISEÑO DEL ESTUDIO

• Número de laboratorios.
• Niveles de magnitud. Se recomienda trabajar con 3 niveles (bajo, medio y alto), para cubrir el mayor recorrido de valores posibles y lograr una buena representatividad.

Estos niveles se pueden definir en función del límite de detección (LD) y los valores máximos normalmente encontrados del compuesto que se determina en este tipo de ensayo para los sustratos específicos.4,6,7

Nivel bajo: Desde LD hasta 0,1 x

Nivel medio: Desde LD + 0,45 x hasta LD + 0,55

Nivel alto: Desde LD + 0,9 x hasta LD + x

Número de réplicas: Lo más usual es 2 ó 3 réplicas.

ELABORACION DE INSTRUCTIVO PARA LA EJECUCION DEL ESTUDIO

Junto con las muestras se envía una guía o instructivo; no existe un formato específico, pues éste se adecua al tipo de estudio, al análisis y a la muestra utilizada. Sin embargo, existen algunos aspectos que deben incluirse en cualquier instructivo, tales como:

• Forma de manipular la muestra.
• Número de réplicas por cada muestra.
• Forma de expresar los resultados y las cifras significativas hasta las cuales se desea expresar los resultados.
• Datos sobre el control de calidad interno, curvas de calibración y otros.
• Método analítico empleado (en caso de no evaluarse el método).
• Tiempo en que deben hacerse los análisis.
• Cualquier información sobre posibles alteraciones durante la ejecución que se considere, puede influir en la evaluación e interpretación de los resultados.

PROCEDIMIENTO

El centro coordinador, después de realizar las operaciones preliminares, desarrollará el procedimiento siguiente:

• Envío de muestras e instructivos a los laboratorios participantes.
• Solicitud de resultados según el tiempo previsto en el instructivo.
• Recopilación y análisis preliminar de datos.
• Procesamiento estadístico de los resultados.

RECOPILACION Y ANALISIS

PRELIMINAR

Cuando se reciben los datos provenientes de los laboratorios, se examinan exhaustivamente y se eliminan los valores groseros.

Posteriormente se pueden aplicar diferentes pruebas estadísticas para eliminar valores de límites, por ejemplo, Dixon y Cohran (ver ISO 5725:86).

PROCESAMIENTO ESTADISTICO

Para la evaluación de un método analítico se aplicará la metodología establecida en la ISO 5725:86, donde se informan los valores de media (X), desviación estándar (S), repetibilidad (r) y reproducibilidad interlaboratorio (R).

Cuando se evalúe la aptitud de los laboratorios participantes, para conocer el índice de precisión se utilizará el coeficiente de variación (CV), donde:

CV = S x 100
---------
X

Para valores bajos se aceptará CV

20 %; para valores medios hasta 15 %; para valores altos hasta 10 %.

Para conocer el índice de exactitud (E) se podrá comparar el resultado medio (X) contra el valor certificado o conocido de la muestra (VC), expresado como porcentaje del valor certificado, donde:

E = (X - VC) x 100

Este valor no deberá superar el límite 10 %.

También se puede aplicar el estadígrafo t de Student de 2 colas para

P <>

Opcionalmente, pueden hacerse gráficos para observar el comportamiento de blancos y recobrados, lo cual da una noción de las desviaciones producidas por impurezas de reactivos e interferencia respectivamente.6 Para la mayoría de los análisis químicos se consideran como valores aceptables entre el 80 y 110 %.

RETROALIMENTACION

El centro coordinador será el responsable de elaborar el informe final del estudio interlaboratorio, el cual incluirá los siguientes aspectos:

• Parámetros evaluados y método de análisis utilizado.
• Material de ensayo y forma de preparación (si es necesario).
• Número de laboratorios que informaron.
• Número de laboratorios eliminados estadísticamente.
• Niveles de concentración utilizados en el estudio.
• Tabla de resultados.
• Parámetros estadísticos.
• Evaluación de los resultados.

El informe final deberá enviarse a los participantes de forma manuscrita antes de publicarse para enmendar cualquier posible error en los datos.

El informe final será publicado de forma accesible y estará disponible a todos los participantes.

ACCIONES CORRECTIVAS

Los resultados permiten evaluar los laboratorios participantes con el ánimo de realizar acciones correctivas, las cuales pueden solicitarse al centro coordinador por el propio laboratorio afectado o pueden tomarse internamente.

Dentro de las acciones correctivas podemos citar las siguientes:

• Asesoría directa y sistemática.
• Auditorías al sistema de calidad del laboratorio.
• Capacitación del personal.

Bibliografía

Anexo 19 muestras de referencia y muestras de retención agencia española de medicamentos y productos sanitarios. Ministerio de sanidad y consumo.

Olga Valdés Almaral,¹ María V. Luna,² Esther Lukse³ y Carlos García Pino^{4 -} Revista Cubana Aliment Nutr 1995;9(1): Pautas para estudios interlaboratorios de análisis químico.

Catalogo de MRCs del laboratorio Mol labs de quimiométricas para el año 2010

Mª Carmen Yebra Biurrun. Análisis químico

David Harvey. Química analítica moderna. Mc Graw Hill. 2002

Determinación de cromo en orina - Método de cámara de grafito / Espectrofotometría de absorción atómica. Instituto nacional de seguridad e higiene en el trabajo. Ministerio de trabajo y asuntos sociales.

Jordi Riu. Materiales de referencia certificados. Grupo de Quimiometría y Cualimetría. Universitat Rovira i Virgili